流產(chǎn)物拷貝數(shù)變異（Copy Number Variation, CNV）檢測(cè)，是指通過對(duì)妊娠期流產(chǎn)/引產(chǎn)組織、絨毛、臍帶血樣本進(jìn)行全基因組測(cè)序，從而判斷流產(chǎn)組織染色體是否存在變異的一種技術(shù)。結(jié)合夫妻雙方的遺傳背景，該技術(shù)可為孕婦不明原因流產(chǎn)尋找可能的遺傳因素，發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)發(fā)生的根源，幫助醫(yī)生從更科學(xué)的角度合理的指導(dǎo)夫婦再次備孕。
在真邁生物2020年度國產(chǎn)測(cè)序平臺(tái)及應(yīng)用創(chuàng)新論壇上，時(shí)任上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院（以下簡(jiǎn)稱“國婦嬰”）生殖遺傳科主任的徐晨明教授（注：徐教授現(xiàn)已就職于復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院）就孕婦流產(chǎn)原因及篩查方法做了詳細(xì)的報(bào)告，并結(jié)合臨床研究案例分享了使用單分子測(cè)序平臺(tái)GenoCare 1600進(jìn)行CNV-seq檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)和經(jīng)驗(yàn)。
有多少自然流產(chǎn)是由CNV引起的？
自然流產(chǎn)是指由于非人為因素導(dǎo)致妊娠在28周前終止且胎兒體重<1000g的流產(chǎn)，其發(fā)生率占全部妊娠的約15%~20%，其中80%以上為早期自然流產(chǎn)。
自然流產(chǎn)主要由3大因素引起：一是藥物、酒精、化學(xué)制劑、細(xì)菌、病毒等環(huán)境因素；二是內(nèi)分泌異常、免疫功能異常、宮頸功能不全、子宮畸形、血栓形成、年齡、BMI、吸煙等母體因素；三是染色體疾病、單基因疾病、基因組疾病、多基因疾病等遺傳因素。
而在這三種引起自然流產(chǎn)的因素中，早期自然流產(chǎn)約有50%-60%是由染色體異常導(dǎo)致的。染色體異常會(huì)影響眾多基因的表達(dá)和作用，破壞基因的平衡狀態(tài)，從而妨礙胎兒相關(guān)器官的分化、發(fā)育及某些功能發(fā)生異常而引發(fā)胎停、流產(chǎn)。
染色體導(dǎo)致的致病因素包括染色體數(shù)目異常（約占86%）、結(jié)構(gòu)異常（約占6%），以及嵌合體（約占8%）。流產(chǎn)的孕周越小，檢出的染色體異常比例越大。
CNV檢測(cè)有哪些方法？
美國生殖醫(yī)學(xué)會(huì)建議在流產(chǎn)后進(jìn)行相關(guān)檢查來查明流產(chǎn)原因，例如通過核型分析、染色體微陣列分析技術(shù)（chromosome microarray analysis, CMA）對(duì)夫妻雙方及胎兒流產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)從而判定是否存在染色體異常。
常見CNV篩查方法及特點(diǎn)對(duì)比：
核型分析檢測(cè)周期長(zhǎng)、分辨率低，無法檢出5Mb以下CNVs。
CMA通量低、成本高、探針覆蓋范圍有限，無法準(zhǔn)確分析＜30%的嵌合體。
CNV-seq技術(shù)無需細(xì)胞培養(yǎng)，測(cè)序完成后，通過計(jì)數(shù)每條染色體拷貝數(shù)的細(xì)微改變，來精確判斷嵌合體比例，故CNV-seq可以實(shí)現(xiàn)對(duì)低比例嵌合體更好的檢測(cè)，可為臨床醫(yī)生提供更為準(zhǔn)確可靠的產(chǎn)前診斷結(jié)果。
CNV-seq技術(shù)優(yōu)點(diǎn)
檢測(cè)范圍廣：包括非整倍體、大片段缺失重復(fù)、全基因組CNV
高通量：同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣本的檢測(cè)
操作簡(jiǎn)便：流程簡(jiǎn)便，節(jié)省人力
兼容性好：一臺(tái)測(cè)序儀可同時(shí)開展NIPT與CNV-seq
檢測(cè)周期短：基因測(cè)序、自動(dòng)化數(shù)據(jù)分析、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)清晰，報(bào)告周期短
分辨率高：可檢測(cè)低至100Kb的CNV
低比例嵌合的檢測(cè)：可檢測(cè)低至5%的染色體非整倍體嵌合，在臨床樣本中可發(fā)現(xiàn)超過10%的染色體非整倍體嵌合
CNV-seq還有哪些痛點(diǎn)有待解決？
傳統(tǒng)的建庫過程需經(jīng)過PCR進(jìn)行DNA片段的富集，而在富集的過程中會(huì)不可避免的引入擴(kuò)增錯(cuò)誤和偏向性，這意味著上機(jī)測(cè)序的文庫片段已經(jīng)無法真實(shí)反映原始樣本的情況，同時(shí)也帶來dup偏高、測(cè)序數(shù)據(jù)浪費(fèi)偏多的問題。這對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其對(duì)于微缺失/重復(fù)（CNV）檢測(cè)，會(huì)造成比較大的影響。
嵌合的檢出缺憾：由于富集引入的PCR bias對(duì)于較低比例的嵌合，也帶來了檢出困擾。
單分子測(cè)序平臺(tái)GenoCare為何能解決CNV-seq痛點(diǎn)？
1 無需擴(kuò)增，建庫時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便高效GenoCare gDNA文庫構(gòu)建試劑盒將DNA片段化、末端修復(fù)以及末端加dA尾合并為一步，產(chǎn)品無需純化，可直接進(jìn)行接頭連接，采用一管式操作，流程簡(jiǎn)化，操作簡(jiǎn)便，且無PCR過程，可極大縮短建庫時(shí)間。
GenoCare與其他測(cè)序平臺(tái)樣品處理過程對(duì)比：
2 最大程度利用樣品，保持樣品的多樣性和原態(tài)性
GenoCare與其他測(cè)序平臺(tái)樣品處理及質(zhì)控結(jié)果對(duì)比：
GenoCare 1600測(cè)序平臺(tái)：樣品投入量15-50ng
其他測(cè)序平臺(tái)：樣品投入量約1ug
3 在線分析系統(tǒng)，為臨床工作人員提供一鍵化的結(jié)果
4?GC bias影響極小，為低比例嵌合樣品的檢出提供穩(wěn)定保障
整個(gè)樣品制備和測(cè)序過程并沒有PCR, 可以極大程度解決二代測(cè)序引物的GC偏好性，從而提高對(duì)于小片段微缺微重樣品及較低比例嵌合異常的樣品的檢出。
GC bias 經(jīng)多次重復(fù)測(cè)試均值約0.02-0.04，為低比例嵌合樣品的檢出提供了穩(wěn)定的保障。
單分子測(cè)序平臺(tái)GenoCare在CNV-seq檢測(cè)中的臨床案例檢出結(jié)果舉例
真邁生物開發(fā)的基于單分子測(cè)序平臺(tái)的流產(chǎn)物CNV的整套解決方案，在國婦嬰完成了共計(jì)500例的流產(chǎn)物樣品檢測(cè)，初期選擇了150例各種類型的陽性樣品進(jìn)行雙盲測(cè)試，測(cè)試結(jié)果與其他NGS測(cè)序平臺(tái)結(jié)果完全一致。部分CNV檢出結(jié)果示例：
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